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Detección del virus de la hepatitis C (VHC) en saliva de pacientes crónicamente infectados de Córdoba, Argentina.
Adrián Farías, ¹ Viviana Ré, ¹ Silvia Mengarelli, ² Luis Kremer, ³ Maria Belén Pisano¹,  Luis Allende³, Juan Nicolás,  Osvaldo Elbarcha,  Marta Contigiani¹.
Revista Facultad de Ciencias Médicas 2009; 66(Supl. 1):15-20

1  Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas – Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba,

    Argentina.
2  Hospital San Roque-Córdoba, Argentina.
3  Hospital Nacional de Clínicas-Córdoba, Argentina.
4  Cátedra de Virología. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Católica de Córdoba, Argentina.

Introducción

En los últimos 20 años el virus de la hepatitis C (VHC) ha emergido como la segunda principal causa de infección viral luego del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se estima que aproximadamente el 3% de la población mundial está infectada con VHC y ésta infección es crónica en el 80% de los casos (1).

El VHC comparte vías de transmisión con VIH, pero las tasas de infección están relacionadas al nivel de exposición de la población involucrada. Así, la coinfección VIH/VHC representa un gran problema en crecimiento. Esta coinfección acelera la progresión de injuria y descompensación hepática provocada por VHC, parece empeorar la progresión de la infección por VIH e incrementa la transmisión de VHC (2).

En Córdoba, un estudio reciente en individuos VIH (+), demostró una alta prevalencia de HCV (12,3%), representada por el genotipo 1 y asociada principalmente al uso de drogas inyectables. Sin embargo, el hallazgo de ARN de VHC en 10,5% de los individuos sin antecedentes de riesgo parenteral sugería una vía alternativa de transmisión (3).    

Si bien, la vía de transmisión parenteral se considera la más eficiente, en aproximadamente 30% de los casos se desconoce la ruta de infección (1). Por esto, se han propuesto otras vías posibles de transmisión, de riesgo incierto, que podrían estar relacionadas a la infección por VHC como son: el uso de tatuajes, el uso de cocaína inhalatoria,  acupuntura y procedimientos médico- odontológicos (4, 5, 6). 

Estudios recientes han demostrado la presencia de ARN de VHC en saliva de individuos crónicamente infectados, lo cual sugiere a ésta como otra posible vía de infección (7). A su vez, se ha demostrado que niveles mayores de carga viral favorecerían la detección de VHC en saliva (7, 8, 9). El aumento de la replicación de VHC favorecido por la inmunosupresión en pacientes VIH (+) y/o por la presencia de infección VHC aguda, podría estar asociada a un aumento de la replicación viral en células mononucleares de sangre periférica y células epiteliales de la mucosa genital u oral, en las que se demostró que poseen un receptor celular (CD81) que une la proteína de la envoltura del VHC y produce la internalización del virus (10). Esto podría explicar el hallazgo de VHC en otros fluidos biológicos, que podrían estar involucrados en la transmisión del virus (10).

El objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de ARN en la saliva de individuos crónicamente infectados y estudiar el real impacto de la coinfección con VIH, y su asociación con la carga viral, el genotipo VHC, factores de riesgo y edad. 

Materiales y Métodos

Pacientes y toma de muestras
Se estudiaron 37 pacientes (21 males/16 mujeres), dieciséis de ellos eran co-infectados con VIH. Todos los sujetos tenían ARN del VHC detectable en el suero mediante RT-Nested PCR  y no se encontraban bajo tratamiento antiviral. Las muestras de suero fueron re-analizadas para confirmar la presencia de ARN del VHC en el momento de tomar las de saliva. Todos los especímenes fueron congeladas a -70^oC hasta la detección del ARN viral.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Córdoba y se llevó a cabo de acuerdo con las normas de ética  internacionales. Se obtuvo el Consentimiento informado por escrito de todos los pacientes incluidos en este estudio.

Procesamiento de Suero y Saliva
En todos los pacientes, se recolectó muestras de sangre y se separó el suero, el cual se almacenó a-20^oC hasta su procesamiento.
Las muestras de saliva se recogieron sin estimulación mecánica en un tubo (Falcon) estéril. La saliva fue procesada por centrifugación y se realizó un control visual para detectar la presencia de células de la sangre. Ninguna de las muestras contenía  sangre en el exámen macroscópico.

Extracción de ARN

A partir de suero, la extracción de ARN viral se realizó con el reactivo Trizol LS (Invitrogen, Life Technologies, Rockville, MD). En la muestras de saliva se utilizó el ARN viral QIAamp Kit (QIAGEN GmbH, Alemania) según las instrucciones del fabricante.

RT-nested PCR
La presencia de ARN del VHC se determinó mediante la técnica de RT-nested PCR  utilizando primers específicos de la región 5 'no codificante  (5'NCR), como fue descrito por Ré y col., (11).
Genotipificación

La determinación del genotipo del VHC se realizó mediante el análisis de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP) de la región 5'NCR. Este método (RFLP) permitió distinguir adecuadamente los genotipos 1, 2 y 3 (11).

Secuenciamiento de la región NS5B

La amplificación de la región no estructural 5B (NS5B) y posterior secuenciamiento directo se realizó como se describió anteriormente por Chen y Weck, (12); a fin de confirmar los resultados obtenidos por la técnica de RFLP.
Cuantificación del ARN del VHC en el suero
El ARN del VHC en el suero se cuantificó con el equipo QT VHC NASBA (Organon Teknika, Boxtel, Países Bajos).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante SPSS para Windows y los valores de p < 0,05 fueron considerados significativos. El Test de Student se usó para comparar las variables continuas y Chi-cuadrado o prueba exacta de Fisher para la comparación de proporciones.

Resultado

Las características de la población, edad, sexo, factores de riesgo, carga viral del VHC en suero y los genotipos de VHC fueron registradas (Tabla I).
La prevalencia de ARN del VHC en la saliva fue del 21.6 % (8 / 37). Los resultados de la detección de VHC en saliva y su asociación con la vía de transmisión de VHC, la edad, coinfección con VIH, genotipo y carga viral del VHC se muestran en la Tabla II.

La distribución de los genotipos del VHC en los pacientes monoinfectados fue la siguiente: 48% (10/21) de genotipo 1, 43% (9 / 21) genotipo 2 y el 9% por el genotipo 3 (2 / 21). Para los pacientes co-infectados VIH/VHC, la distribución de genotipos fue de 76% (13/17), el 6% (1 / 17) y el 18% (3 / 17), respectivamente (Tabla I).

Los genotipos detectados en suero coincidieron con los detectados en saliva. 

Discusión

La posibilidad de que la saliva sea una vía no parenteral de transmisión ha sido sugerida por una gran variedad de estudios. Ya en 1987, un estudio realizado por Abe y col., (13) describe la infección aguda en un chimpancé luego de la inoculación de saliva de un primate con hepatitis no A- no B. Estudios basados en la amplificación molecular de ARN de VHC en saliva reportan resultados variados con rangos de 0 (14) a 100% (15). Sin embargo, ninguno de estos estudios incluye datos que demuestran la infectividad del ARN del VHC detectado en saliva. En este sentido, Arrieta y col., (16) reportaron la detección de intermediario replicativo y antígeno core de VHC en el tejido de la glándula salival de 8 pacientes crónicamente infectados.

En nuestro estudio, demostramos la presencia de  ARN- VHC en el 21,6% de las salivas estudiadas, mucho menor a la prevalencia hallada por Gonzalvez y col., (17). Las discrepancias encontradas entre los estudios reportados podrían deberse a la ausencia de métodos estandarizados tanto para la toma de muestras como para los métodos de centrifugación, congelación y detección de este virus en saliva. Otra explicación posible podría darse en la presencia de sangre oculta y/o de células en las salivas de estudio.  A pesar de que a VHC se lo ha encontrado en los leucocitos y las células epiteliales orales (16), las muestras de saliva de este estudio estaban libres de tales células. Las pruebas específicas para investigar sangre oculta no se realizaron en este trabajo, pero algunos autores (16,17) han demostrado que entre las personas infectadas con el VHC, la presencia de sangre en muestras de saliva no se correlaciona con la presencia de ARN del VHC en suero (16).

La asociación entre el nivel de ARN de VHC y la excreción en mucosa parece variar durante el curso de la infección. Según fue demostrado por varios autores el ARN es más frecuentemente hallado en saliva cuando la carga viral en suero es mayor (7, 8, 9). Así factores clínicos que están asociados a mayores cargas virales, tales como infección aguda o coinfección VIH/VHC pueden resultar en mayor frecuencia de detección de VHC en saliva.

En concordancia con Lins y col., (18) en nuestro estudio no se halló correlación estadísticamente significativa (p>0.05) entre la presencia de ARN del VHC vs. carga viral y coinfección con VIH. Sin embargo, un mayor porcentaje de detección en saliva se observó cuando la carga viral fue superior a 5 Log (Tabla II).

En cuanto a la detección de genotipos de VHC hallamos igual genotipo en las muestras de suero y saliva de un mismo paciente. Sin embargo, estudios más detallados del genoma viral (subtipos – cuaciespecies) se realizarán en un futuro a fin profundizar estos resultados. En este sentido, recientemente se ha demostrado que VHC posee replicación extrahepática      y varios reportes han demostrado variantes virales intratípicas dentro de los diferentes compartimentos corporales (19, 20, 21).
Nuestros datos muestran que el ARN de VHC está presente en la saliva de individuos infectados con este virus, el mecanismo de excreción de VHC y el rol que cumple ésta en la actual transmisión de la infección a otros individuos aún no está claro. Múltiples factores contribuyen a la infectividad de un fluido biológico, incluyendo la presencia de partículas virales intactas, el título viral adecuado y la presencia de células blancos adecuadas en el área expuesta del individuo susceptible. Actualmente, los datos epidemiológicos no acompañan el concepto de que VHC es eficientemente transmitido mediante saliva. Sin embargo, el uso de cepillo de dientes y los tratamientos odontológicos han sido imputados como vehículos para la transmisión de VHC en varios estudios (22).

Si bien, nuestros resultados, juntamente con los hallazgos de otros autores sustentan la posibilidad de que VHC pueda ser transmitido por saliva en ciertas y determinadas circunstancias, los hallazgos deben ser interpretados con mucha precaución, para evitar una innecesaria preocupación en los individuos infectados por HCV.  

Asimismo, los resultados deben ser tenidos en consideración a fin de guardar las medidas de bioseguridad apropiadas en la atención médico-odontológica.

Agradecimientos

Este estudio fue subsidiado parcialmente por SECYT (Secretaría de Ciencias, Tecnología e Innovación Productiva, Argentina) y SIP-UCC (Secretaría de Investigación y Posgrado- Universidad Católica de Córdoba).

Bibliografía

1- Center for Disease Control and Prevention. Recomendations for prevention and control of hepatitis C virus (HCV) infection and HCV-related chronic disease. Atlanta, MMWR;1998, 47 (No. RR-19).

2- Sherman K E. HCV and HIV: a tale of two viruses. Rev Gastroenterol Disord ;2004, 4: 48-54. [Abstract]

3- Ré V, Gallego S, Farías A, Barbás G, Kremer L, Díaz P, Contigiani M. Hepatitis C infection among HIV-infected subjects: prevalence, genotype characterization and risk factors. Enf Infec Microbiol Clin; 2008,  26: 423-425.

4- De Nishioka S A, Gyorkos T W, Joseph L, et al. Tattooing and transfusion-transmitted diseases in Brazil: a hospital-based cross-sectional matched study. Eur J Epidemiol; 2003, 18: 441-449. [Open Access-PubMed Central]

5- McMahon J M, Simm M, Milano D, Clatts M. Detection of hepatitis C virus in the nasal secretions of an intranasal drug-user. Ann Clin Microbiol Antimicrob; 2004, 3:6. [Open Access-PubMed Central]

6- Terrault N. Sexual  activity as a risk factor for Hepatitis C. Hepatology; 2002, 36: 99-105. [Fulltext]

7- Eirea M, Dios PD, Hermida M, et al. Detection of HCV-RNA in saliva of HIV-HCV coinfected patients. AIDS Res Hum Retroviruses; 2005, 21:1011-1015. [Abstract]

8- Pastore L, Fiore JR, Tateo M, De Benedittis M, Petruzzi M, Casalino C, Genchi C, Lo Muzio L, Angarano G, Serpico R. Detection of hepatitis C virus-RNA in saliva from chronically HCV-infected patients. Int J Immunopathol Pharmaco; 2006. 19:217-224.[Abstract]

9- Wang CC, Morishima C, Chung M, Engelberg R, Krantz E, Krows M, Sullivan DG, Gretch DR, Corey L. High serum hepatitis C virus (HCV) RNA load predicts the presence of HCV RNA in saliva from individuals with chronic and acute HCV infection. J Infect Dis.; 2006, 193:672-676. [Abstract]

10- Manavi M, Baghestain M, Watkins-Reidel T, et al. Detectión of Hepatitis C Virus RNA in Normal Cervical Smears of HCV-Seropositive Patients. Clin Inf Dis.; 2002, 35:966-973. [Fulltext]

11- Ré V, Lampe E, Yoshida CF, de Oliveira JM, Lewis-Ximénez L, Spinsanti L, Elbarcha O, Contigiani M. Hepatitis C virus genotypes in Cordoba, Argentina. Unexpected high prevalence of genotype 2. Medicina; 2003, 63:205-210. [Open Access-Scielo]

12- Chen Z, Weck KE. Hepatitis C virus genotyping: interrogation of the 5' untranslated region cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J Clin Microbiol.; 2002, 40:3127-3134. [Open Access-PubMed Central]

13- Abe K, Kurata T, Shikata T, Sugitani M, Oda T. Experimental transmission of non-A, non-B hepatitis by saliva. J Infect Dis.; 1987, 155:1078-1079. [Abstract]

14- Fried MW, Shindo M, Fong TL, Fox PC, Hoofnagle JH, Di Bisceglie AM. Absense of hepatitis C viral RNA from saliva and semen of patients with chronic hepatitis C. Gastroenterology; 1992, 102:1306-1308.

15- Takamatsu K, Okayasu I, Koyanagi Y, Yamamoto N. Hepatitis C virus propagates in salivary glands. J Infect Dis.;1992, 165:973–974.

16- Arrieta JJ, Rodríguez-Iñigo E, Ortiz-Movilla N, Bartolomé J, Pardo M, Manzarbeitia F, Oliva H, Macías DM, Carreño V. In situ detection of hepatitis C virus RNA in salivary glands. Am J Pathol; 2001, 158:259-264. [Fulltext]

17- Goncalves PL, Cunha CB, Busek SC, Olivera GC, Rivero-Rodriguez R, Pereira FE. Detection of hepatitis C virus RNA in saliva samples from patients with seric anti-HCV antibodies. Braz J Infect Dis.; 2005, 9:28-34. [Open Access-Scielo]

18- Lins L, Almeida H, Vitvisk L, Carmo T, Paraná R, Reis MG. Detection of hepatitis C virus RNA in saliva is not related to oral health status or viral load. J Med Virol.; 2005, 77:216-220. [Abstract]

19- Minosse C, Calcaterra S, Abbate I, Selleri M, Zaniratti MS, Capobianchi R. Possible compartmentalization of hepatitis C viral replication in the genital tract of HIV-1-coinfected women. J Infect Dis.; 2006, 194:1529-1536.[Abstract]

20- Roque-Afonso AM, Ducoulombier D, Di Liberto G, Kara R, Gigou M, Dussaix E, Samuel D, Féray C. Compartmentalization of hepatitis C virus genotypes between plasma and peripheral blood mononuclear cells. J Virol.; 2005, 79:6349-6357.[Open Access-PubMed Central]

21- Blackard JT, Kemmer N, Sherman KE. Extrahepatic replication of HCV: insights into clinical manifestations and biological consequences. Hepatology; 2006, 44:15-22.[Fulltext]

22- Stein JA, Nyamathi A. Correlates of hepatitis C virus infection in homeless men: a latent variable approach. Drug Alcohol Depend.; 2004, 75:89–95.[Abstract]

Tablas

Tabla I. Características de la población de estudio y determinación del genotipo en 37 pacientes infectados con VHC de Córdoba, Argentina.

 

* En algunos casos se observó más de  un riesgo por paciente

** Historia de atención odontológica, medicación con inyectables, transmisión familiar (compartir hojas de afeitar, cepillos de dientes y peines), tatuaje, múltiples parejas sexuales, hombres que tienen sexo hombres (HSH) o diferentes hábitos sexuales.

Tabla II. Detección de ARN del VHC en saliva de 37 pacientes infectados con VHC de Córdoba, Argentina

* En todos los casos p>0,05