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Actividad de virus del complejo encefalitis equina venezolana (VEEV) en Argentina.
María B. Pisano ¹ , Viviana E. Ré ¹, Luis A. Díaz ¹, Marina Stein ², María J. Dantur Juri³, Adrián Farías ¹, María P. Sanchez–Seco 4, Antonio Tenorio 4 , Walter R. Almirón 5,  Marta S. Contigiani ¹.
 

1-Instituto de Virología “Dr. J. M. Vanella”. Fac. Cs. Médicas. UNC. Córdoba, Argentina. 2- Instituto de Medicina Regional. UNNE. Chaco, Argentina. 3- INSUE. UNT. Tucumán, Argentina. 4- Instituto de Salud Carlos III. Majadahonda, España. 5- Centro de Investigaciones Entomológicas de Córdoba, FCEFyN. UNC. Córdoba, Argentina.

INTRODUCCIÓN

Dentro de los alfavirus aislados en América de importancia médico-veterinaria, se encuentra el complejo antigénico Encefalitis Equina Venezolana (EEV), que consta de seis subtipos (I a VI). El subtipo I, a su vez, posee las variedades IAB, C, D, E y F, y el subtipo III las variedades A, B y C. Epidemiológicamente se clasifican en virus enzoóticos y virus epidémicos/epizoóticos. Los primeros (subtipos ID, IE, IF y II al VI), son transmitidos a través de roedores reservorios por mosquitos en hábitats silvestres y ocasionalmente producen enfermedad en humanos. Sin embargo, recientemente un brote epizoótico en México tuvo como responsable al subtipo IE (1). Las cepas epidémicas/epizoóticas (subtipos IAB y IC) emergen periódicamente en regiones de América Central y el norte de América del Sur (Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú), causando brotes que afectan a humanos y equinos con altas tasas de morbilidad y mortalidad (2).
En Argentina se ha aislado la cepa AG80-663 (subtipo VI) (actualmente denominada Virus Rio Negro, VRN, y que sólo circula en nuestro país) a partir de mosquitos (3) y de roedores, la cual ha sido asociada a enfermedad aguda febril (4). Por otra parte, estudios serológicos mostraron la presencia de anticuerpos para virus del subtipo I (aún no aislado en la Argentina) y para VRN, lo que indica que más de un subtipo viral enzoótico es activo en nuestro territorio (5).
Con el objetivo de monitorear actividad del virus EEV en Argentina, se realizó detección del ARN viral mediante RT-Nested PCR genérica para alfavirus en las provincias de Chaco y Tucumán, con posterior secuenciamiento de las muestras positivas y análisis filogenéticos de las mismas.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se colectaron mosquitos en diciembre de 2003 y desde febrero hasta abril de 2004 en la provincia de Chaco (localidades de Monte Ato y Resistencia); y en los meses de marzo, abril, noviembre y diciembre de 2005 y febrero de 2006 en la provincia de Tucumán (San Miguel de Tucumán), mediante trampas de luz tipo CDC complementadas con CO2. Estos mosquitos fueron transportados en frio hasta el laboratorio, donde fueron identificados bajo microscopio estereoscópico y platina refrigerada, y agrupados en pools de hasta 50 individuos por especie. Cada pool fue triturado en mortero frio con Medio Esencial Mínimo (MEM) estéril, suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB) al 10% y gentamicina al 1%, y descontaminado por centrifugación a 10000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante fue alicuotado y conservado a -70ºC hasta detección viral.
El ARN viral fue extraído con el reactivo Trizol (Invitrogen BRL, Life Technologies, Rockville, MD) de acuerdo al protocolo del fabricante. Posteriormente se realizó RT-Nested PCR genérica para alfavirus, amplificando un fragmento de la proteína no estructural 4 (nsP4) (6). Las muestras positivas fueron purificadas utilizando el kit comercial Quiaquick Gel Extraction Kit (Quiagen, Valencia, Ca, USA) y remitidas para secuenciamiento directo en ambas direcciones. Las secuencias obtenidas fueron ingresadas en el banco de datos GenBank. Los análisis filogenéticos fueron construidos con el programa Mega versión 4. Las Tasas Mínimas de Infección (TMI) fueron calculadas de la siguiente manera: TMI = número de amplificaciones virales por especie/número total de especímenes testeados de esa especie para un lugar x 1000.

RESULTADOS

Provincia de Chaco
Se analizaron 2057 mosquitos, agrupados en 99 pools, pertenecientes a 33 especies. Siete pools resultaron positivos para alfavirus: 5 de Monte Alto y 2 de Resistencia. Las Tasas Mínimas de Infección (TMI) mostraron más actividad viral en Monte Alto (área rural) que en Resistencia (área urbana) (Tabla I). Seis secuencias, obtenidas de Culex (Cx.) coronator, Cx. maxi, Psorophora (Ps.) cingulata, Ps. spp y Ps. varinervis, agruparon con VRN (VEEV subtipo VI); y una, obtenida de Oclerotatus (Oc.) hastatus oligopistus, agrupó con Virus Pixuna (VPIX) (VEEV subtipo IV) (Figura 1).
Provincia de Tucumán
Se analizó un total de 4700 mosquitos, agrupados en 139 pools, pertenecientes a 16 especies. Cuatro pools resultaron positivos para alfavirus: 2 obtenidos de Ae. (oc.) scapullaris, uno de Cx. mollis, y uno de Ae. aegypti. Las TMI muestran una actividad viral mayor en Cx. mollis que en las otras especies (Tabla I). Tres pools fueron secuenciados: 2 agruparon con VRN y uno con VPIX (Figura 1).

DISCUSIÓN

Estudios previos en Argentina, llevados a cabo en la provincia de Chaco, postulan Cx. (Mel.) delpontei como el principal vector de VRN (Mitchell et al. 1985). Los datos obtenidos en esta investigación muestran presencia de este virus en mosquitos de otras especies. La no detección de VRN en Cx. (Mel.) delpontei puede deberse a que se colectaron pocos mosquitos de esta especie, en el caso de la provincia de Chaco, y ninguno en la provincia de Tucumán, en donde no hay registros de circulación de la misma hasta la fecha.
Al momento del comienzo de este estudio, en Argentina se conocía la circulación de VRN en la provincia de Chaco. Nuestros resultados confirman que este virus aún circula en la región. Sin embargo, no hay registros previos de detección de VPIX, siendo éste el primer reporte de su detección molecular en el país. Este virus fue aislado por primera vez en Belem, Brasil, en 1961 (7), y ha sido poco caracterizado.
En cuanto a la provincia de Tucumán, nuestros resultados muestran por primera vez presencia de virus del complejo EEV en mosquitos de esa provincia, coexistiendo circulación de dos subtipos enzoóticos, VRN y VPIX, los mismos detectados en la provincia de Chaco. Esto es de especial importancia ya que se ha observado emergencia de cepas epizoóticas patógenas vía mutación de cepas enzoóticas (por interacción entre dos cepas o por mecanismos genéticos de adaptación a nuevos huéspedes) (Powers et al. 1997).
Los datos informados en este trabajo demuestran la necesidad de desarrollar y/o reforzar medidas de vigilancia epidemiológica para el virus EEV en la región norte de nuestro país, a fin de conocer su importancia como patógeno en el área, como así también intensificar medidas de control de vectores, no sólo para este virus, sino para las arbovirosis en general.
Teniendo en cuenta que el VRN fue asociado a enfermedad aguda febril durante un brote humano notificado como posible Dengue (4) es recomendable incluir este virus en el diagnóstico diferencial de síndromes febriles.



BIBLIOGRAFIA
1-González-Salazar D, Estrada-Franco JG, Carrara AS, Aronson JF, Weaver SC. Equine amplification and virulence of subtype IE Venezuelan equine encephalitis viruses isolated during the 1993 and 1996 Mexican epizootics. Emerg Infect Dis; 2003, 9:161-168.[Full Text]
2-Powers A, Oberste M, Brault A, Rico-Hesse R, Schmura S, Smith J, Kang W, Sweeney W, Weaver S. Repeated emergence of epidemic/epizootic Venezuelan Equine Encephalitis from a single genotype of enzootic subtype ID virus. J Virol; 1997, 71: 6697-6705. [Full Text]
3-Mitchell CJ, Monath TP, Sabattini, MS, Cropp C, Daffner J, Calisher C, Christensen H. Arbovirus Investigations in Argentina, 1977-1980. II. Arthropod collections and virus isolations from Argentine mosquitoes. Am J Trop Med Hyg; 1985, 34 (5): 945-955.[Abstract]
4-Contigiani M, Basualdo M, Cámara A, Ramírez A, Díaz G, González D, Medeot S, Osuna D. Presencia de anticuerpos contra virus de la encefalitis equina venezolana subtipo VI en pacientes con enfermedad febril aguda. Rev Arg Microbiol; 1993, 25: 244-251.
5-Cámara A, Díaz G, Vega V, Basualdo M, Contigiani M. Seroprevalence of antibodies to Venezuelan Equine Encephalitis Complex (subtypes IAB and VI) in humans from General Belgrano island, Formosa, Argentina. Rev Inst Med Trop S Paulo; 2003, 45: 201-204.[Abstract]
6-Sánchez-Seco MP, Rosario D, Quiroz E, Guzmán G, Tenorio A. A generic nested-RT-PCR followed by sequencing for detection and identification of members of the alphavirus genus. J Virol Meth; 2001, 95: 153-161.[Abstract]
7-Shope RP, Causey OR, Andrade AH, Theiler, M. The Venezuelan Equine Encephalomyelitis complex of group A arthropod-borne viruses, including Mucambo and Pixuna from the Amazon region of Brazil. Am J Trop Med Hyg; 1964, 13: 723-727. [Full Text]