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TRABAJO ORIGINAL

Rol de las mitocondrias y de las especie reactivas de oxigeno en la pro-gresion de la insuficiencia cardiaca
Role of mitochondria and reactive oxygen species in the progression of heart failure
Gustavo Guzmán Mentesana; Alejandra Baez; Roque Córdoba; Ricardo Domínguez; Silvina Lo Presti; Walter Rivarola; Patrícia Pons; Ricardo Fretes; Patrícia Paglini-Oliva.
Revista Facultad de Ciencias Medicas 2010; 67(4): 150-158

Cátedras de Física Biomédica, Histología y Microscopía Electrónica, Universidad Nacional de Córdoba, Sanatorio Allende y Clínica Aconcagua, Córdoba , Argentina

Introducción

La compresión de los mecanismos que conducen a la insuficiencia cardiaca, es uno de los mayores retos de la cardiología actual. Interpretar las vías neurohormonales y como éstas interactúan a nivel celular y molecular, es el comienzo para alcanzar este gran objetivo. ()
El corazón es un órgano con un gran consumo de energía por ello es altamente oxidativo; este vital recurso es aportado por las mitocondrias que representan aproximadamente el 30% del volumen total de los cardiomiocitos y le proveen el 90% de la energía que ello requieren(). Tal actividad oxidativa las hacen blancos de las especie reactivas del oxigeno (ROS). ().
Involucrado en la vía de síntesis del ROS, moléculas inestables, se encuentran la enzima oxido nitro sintasa (NOS), de las cuales se reconocen dos isoformas: las constitutivas (NOS endotelial eNOS, NOS neural nNOS) y las inducibles (iNOS) (1). El rol principal de las NOS es la síntesis del oxido nítrico (NO) el cual participa de forma importante en la funcionamiento cardiaco provocando efectos vasculares como vasodilatación y no vasculares como su intervención en la regulación de la producción de energía en la cadena respiratoria 2 .
La mayor parte del oxígeno utilizado por los miocitos es reducido a agua por vía del complejo IV mitocondrial. En esta reducción del O2 pueden producir radicales libres dependientes del oxigeno (ROS) como ser aniones superóxido (O2-), peróxido de hidrogeno (H2O2) y radicales hidroxilo (OH); por otro lado la reacción del anión superόxido origina los peroxinitritos (ONOO-) llamado especies reactivas del nitrito (ERN) que son altamente citotóxicos ya que causan la oxidación de los fosfolípidos de membrana, proteínas y material genético (3), estos ha sido implicados en una amplia gama de condiciones patológicas incluyendo lesión de isquemia, enfermedades neurodegenerativas y el envejecimiento. En virtud de los efectos tóxicos que estas biomoleculas producen a nivel celular, existen enzimas (basureros) como: superóxido dismutasa (SOD), glutation peroxidasa (GSHPx), catalasa y otros antioxidantes no enzimáticos capaz de prevenir de los efectos tóxicos de los ROS. Sin embargo si la producción de ROS es excesiva el estrés oxidativo puede tener un efecto perjudicial sobre la función y la integridad de los tejidos biológicos (4).
Estudios experimentales y clínicos han sugerido que el estrés oxidativo es uno de los principales parti-cipantes en la remodelación y fracaso miocárdico, estos hechos se asocian a que los corazones con in-suficiencia cardiaca congestiva (ICC) presentan un incremento de ROS y reducción de enzimas anti-oxidantes, además este aumento crónico de radicales dependiente del oxígeno en la mitocondria puede conducir a un ciclo catastrófico de daños en el ADN mitocondrial (ADNmt), así como la disminución funcional del miocardio mediada a través de una lesión celular. Especies reactivas de oxígeno pueden inducir hipertrofia del miocito, apoptosis y fibrosis intersticial mediante la activación de metaloproteinasas de matriz. Estos eventos celulares juegan un papel importante en el desarrollo y la progresión de la remodelación miocárdica (5).
También se han hallado en músculo cardiaco alteraciones a nivel ultraestructural, principalmente en la estructura y función mitocondrial(6-7); en miocardiopatias hipertrofias y dilatadas se identifican defectos en la cadena respiratoria y en la fosforilación oxidativa (8,9), así como mutaciones en el citocromo c y deleciones del DNA mitocondrial, cuya relación con la cardiopatía aún no ha sido explicada (7, 9, 10); los defectos de conducción y las arritmias se han detectado en pacientes que también tenían alteraciones en la  oxidación.
Por otro lado se han postulados que las alteraciones mitocondriales para el músculo cardiaco serian acompañados de daños similares en al misma organela del músculo esquelético(11).
Es por ello que el objetivo del presente trabajo fue establecer la influencia del ROS (medida por el ion peroxidonitrito y la enzima iNOS) sobre la estructura y función mitocondrial de músculo cardiaco y es-quelético en pacientes con insuficiencia cardiaca congestiva (ICC) grado III y IV según New York Heart Association (NYHA), hecho que contribuiría por un lado a la mejor comprensión de los factores involucrados en la progresión de la ICC y por otro conocer el estado celular del corazón mediante una biopsia de cualquier músculo estriado.

Materiales y Métodos

Pacientes
Fueron incluidos en este estudió aquellos pacientes que fueron sometidos a cirugía cardiovascular por diferentes motivos; a ellos se les confeccionó una historia clínica con datos epidemiológicos, metabólicos, hábitos tóxicos, signos y síntomas de los diferentes grado de insuficiencia cardiaca congestiva como así también fármacos utilizados para su tratamiento. De ellos se obtuvo una muestra de ventrículo izquierdo y de músculo esquelético (músculo pectoral mayor) de 1 mm2.

Criterios de inclusión
Pacientes control (n= 7)
1. Paciente menores 40 años, de ambos sexos.
2. Fracción de Eyección > 60%.
3. Sin enfermedad reumatológicas.
4. Con comunicación Interauricular como diagnostico previo a la cirugía.

Pacientes con miocardiopatías (n=18)
1. Pacientes mayores de 40 años, ambos sexos.
2. Enfermedad Cardiovascular Secundaria.
3. ICC grado III – IV según la NYHA.
4. Sin enfermedades reumatológicas o inmunológicas.

Preparación del material para microscopia electrónica.
Las biopsias de miocardio y músculo esquelético de los pectorales, se fijaron en solución de Karnovsky compuesto de una mezcla de formaldehído al 4 % y glutaraldehído 1.5% en el tampón cacodilato 0.1 M durante un período mínimo de 2 hs a temperatura ambiente. El glutaraldehído al 25% fue previamente purificado por destilación y el formaldehído preparado por depolimerización de paraformaldehído en solución acuosa a 80º y con ligera alcalinización. A continuación, el tejido fue lavado 3 veces en tampón cacodilato y tratado con tetróxido de osmio al 1% en la misma solución tampón a temperatura ambiente durante 1-2 hs. Luego, el material fue deshidratado en soluciones acuosas de acetona de graduaciones crecientes (50%, 70% y 90%) durante 5 minutos en cada uno de ellas y el proceso fue completado con 3 pasajes, de 15 minutos cada uno, en acetona 100% destilada y deshidratada sobre tamiz molecular Nº 3 (Merck). La inclusión de las células se realizó en una mezcla de resina epóxicas compuesta de: Araldita 506 (48.5%), Anhidrido dodecenilsuccínico (DDSA) (48.5%), Dibutilftalato (DBP) (0.5%), Acelerador dimetilaminobenceno (BDMA) (2.5%).

Estudios ultraestructurales
El examen se llevó a cabo con microscopio electrónico de transmisión Zeiss. La randomización fo-tográfica no fue completa ya que fueron excluidas aquellas que presentaron artefacto de técnicas. La decisión de excluirlas fue tomada por dos observadores expertos. El área fotografiada fue magnificada a 10000 y 27800 X y magnificaciones mayores fueron utilizadas para detalles específicos. De la biopsia de 1 mm2 se le realizaron los cortes y se eligieron 10 cortes seriados a los que se tomaron en promedio 2.5 micrografías por corte. Los cambios estructurales observados se analizaron con el programa axion-vision 4.6, referenciados a una escala de 1 μm, a través del ello se determino el área promedio ocupadas por las mitocondrias y diámetro promedios de las mitocondrias en los diferentes tejidos.

Aislamiento mitochondrial
La biopsia de músculo esquelético y cardiaco fueron lavados y suspendidos en un buffer a 4ºC inme-diatamente homogeneizado. Los homogenatos fueron centrifugados a 1500 g, 4ºC por 20 min y el so-brenadante transferido a un nuevo tubo, se centrifugó nuevamente a 10000 g 4ºC por 5 m. El pellet obtenido se lavó con el buffer y centrifugó a 10000 g 4ºC por 10 m dos veces. El pellet rico en mitocondrias se resuspendió en buffer (relación tejido/buffer: 1/1) y las alícuotas se guardaron a –80ºC. La concentración de proteínas se midió por el método de Bradford. Esta fracción sirvió para determinar:

Estudio de actividad functional
Actividad de la cadena respiratoria a través del complejo III (ubiquinona-citocromo c oxidoreductasa): las mitocondrias fueron suspendidas en 50 mM Tris-HCL de buffer, pH 7.4 que contenía 1mM EDTA, 250 mM sacarosa, 2mM KCN y 50 µM citocromo c oxidado. Después de la adición de 80µM de DB (DBH2) reducido, se midió la reducción de citocromo c a 550 nm (ε 19.0 mM-1 cm-1). Los resultados de la actividad enzimática se expresaron en µM de ubiquinona min-1 mg prot.

Estudio de inmunohistoquimica
La expresión proteica de NOSi se analizó usando anticuerpos Ig G policlonal específicos contra el ex-tremo amino terminal de iNOS (Santa Cruz Biotechnology Company, Inc. Sc8310).
Los cortes se desparafinaron con xilol y rehidrataron en una serie sucesiva de alcoholes (100º, 96º, 70º, 50º) hasta llegar a PBS 1X pH 7,3. La actividad peroxidasa endógena se bloqueo con peróxido de hidrógeno 3% en PBS por 15 minutos.
Los sitios de unión inespecífica de las inmunoglobulinas fueron bloqueados por un preincubado de 15 minutos con 5% de SBF (GIBCO BRL, Grand Island, N. Y.) diluido en PBS, y se lavó 3 veces con PBS.
Se incubaron los cortes con el anticuerpo primario, anti IgG de humano contra NOSi obtenido en conejo en una dilución 1:200 durante la noche a 4ºC.
Luego de descartar el anticuerpo primario y secar alrededor del corte se coloco el anticuerpo secundario, anti-IgG Biotinilado en PBS por 30 minutos a temperatura ambiente. Se lavó tres veces con PBS y se secó.
Se coloco la Peroxidasa conjugada con Estreptavidina por 20 minutos a temperatura ambiente, y luego de lavar y secar se incubo con la solución del sustrato de la Peroxidasa y el cromógeno, DAB (3,3’diaminobencidina) en Peróxido de Hidrógeno 0,3% H2O2 en Buffer Tris 0,05M pH 7,6 controlan-do en microscopio hasta obtener coloración, aproximadamente 1 minuto.

Análisis de la producción de Nitrotirosina
Se realizó en cortes de 5µm montados en vidrios con gelatina la inmunomarcación para la nitrotirosina como un índice de estrés oxidativo.
Los cortes se desparafinaron con xilol y rehidrataron en una serie sucesiva de alcoholes (100º, 96º, 70º, 50º) hasta llegar a PBS 1X pH 7,3. La actividad peroxidasa endógena se bloqueo con peróxido de hidrógeno 3% en PBS por 15 minutos.
Los sitios de unión inespecífica de las inmunoglobulinas fueron bloqueados por un preincubado de 1 hora con 20% de SBF (GIBCO BRL, Grand Island, N. Y.) diluido en PBS.
Se incubaron los cortes con el anticuerpo primario: anticuerpo monoclonal anti – nitrotirosina de conejo 1/100 (24 horas en cámara húmeda a 4 °C )
Luego de descartar el anticuerpo primario lavar con PBS, se secó alrededor del corte se coloco el anti-cuerpo secundario, multilinker, anti-IgG Biotinilado en PBS por 1 hora a temperatura ambiente en cámara húmeda. Se lavó tres veces con PBS y se secó.
Se colocó la Peroxidasa conjugada con Estreptavidina por 20 minutos a temperatura ambiente, y luego de lavar y secar se incubo con la solución del sustrato de la Peroxidasa y el cromógeno, DAB (3,3’diaminobencidina) con Peróxido de Hidrógeno 0,3 % H2O2 en Buffer Tris 0,05M pH 7,6 contro-lando en microscopio hasta obtener coloración, aproximadamente 1 minutos.

Análisis Estadísticos
Los análisis estadísticos utilizados fueron ANOVA y Χ2, estableciéndose diferencias significativas cuando p <0.05.

Resultados

Morfología de las mitocondrias del músculo cardiaco
Se analizaron las diferencias encontradas en las mitocondrias aisladas de ventrículo izquierdo del grupo con ICC grado funcional de la NYHA III – IV y se compararon con las del grupo control.
Se observó un marcado polimorfismo ultraestructurales (figura 1) en el grupo con ICC siendo los as-pectos como lisis y dilatación de crestas, aumento de matriz (edema) los hallazgos mas representativos; también se observó una reducción del área total ocupadas por las mitocondrias del 78% en los pacientes con ICC vs control 160,37µm 2±9,87; 936,81µm 2±78,48 respectivamente (figura 2) p<0.0001. Alteraciones similares se observaron en el músculo esquelético (figura 1) con una reducción del área mitotocondrial total en un 75% con respecto al control 90,86µm 2±6,87; 550,62µm 2±56,48 respectiva-mente p<0.0001.

Es de marcar que el área ocupada por las mitocondrias en el músculo cardiaco es notablemente mayor que el área ocupada por dicho organoide en músculo esquelético, respetando una relación 1,7:1 esta tendencia se mantiene tanto en el grupo control como en el grupo con ICC (figura 3) p<0.0001.


 

Actividad enzimática del CIII
Se observo una reducción del 70% en la actividad del complejo III (figura 4) en pacientes con ICC gra-do funcional de la NYHA III – IV comparado con el control 1,9 10-2 mM ubiq.mim-1.mg prot ± 12,6; 5,79 10-2mM ubiq.mim-1.mg prot±36,6, p<0,001.
 

Análisis Inmunohistoquimico
Con el objetivo de demostrar la producción de ROS se llevaron a cabo estudios inmunohistoquímicos que demostraron a través de la lipoperoxidacion y la presencia de la enzima oxidonitro sintasa inducible (iNOS) una marcación intensa de distribución difusa en más del 80% para nitrotirosina e iNOS en el músculo cardiaco del grupo con ICC en comparación con el grupo control (Tabla 1). La marcación para iNOS estuvo presente en membrana y citoplasma en cambio la nitrotirosina solo en citoplasma.
Por otro lado en el músculo esquelético de estos mismos pacientes se observó una leve marcación difusa en todos los casos con una distribución similar a la observada en miocardio, no mostrando diferencia con el grupo control (figura 5).
 

Discusión

El corazón es un tejido altamente oxidativo y esencialmente dependiente de la energía que aportan las mitocondrias para contraerse y llevar a cabo otras actividades metabólicas, representan aproximada-mente el 30% del volumen total de los cardiomiocitos y le proveen el 90% de la energía.
La producción de energía por parte de las mitocondrias dependen de factores genéticos del DNA mito-condrial (12-13) que modulan el normal funcionamiento de la actividad enzimática de la organela y de fac-tores ambientales que incluyen los aportes de azúcares, lípidos, proteínas y oxígeno (14).
Cambios en la estructura y la función de las mitocondrias se han encontrado cada vez más asociados con las enfermedades cardiovasculares como hipertrofia y la miocardiopatía dilatada,(8,9), muerte súbita, miocardiopatía isquémica, alcohólica y miocarditis.
En el presente trabajo se observaron que los pacientes portadores de ICC grado III-IV presentaron en musculo cardiaco una reducción del área ocupada por las mitocondrias del 78% con respecto al control (p<0.0001), también se observaron en dichos organoides degeneración hidrópica, alteraciones en mem-brana externa y crestas mitocondriales sugieren un daño grave e irreversible de la mitocondria, imposi-bilitando a ésta a mantener un potencial de membrana mitocondrial efectivo debido a la perdida el gra-diente transmembrana. La disminución en la capacidad de generar energía se puede presuponer por una disminución en la superficie de la membrana interna (crestas) que es el sitio de anclaje de la cadena respiratoria. Estos sitios claves de lesión condicionaría una alteración en la homeostasis mitocondrial y celular, motivo por el cual se activaría las vías apoptóticas del miocardio que conducen directa o indi-rectamente al remodelado cardiaco (15).
Alteraciones estructurales similares se encontraron en el musculo esquelético de los pacientes con ICC como ser una disminución del área ocupadas por las mitocondrias del 72% como respecto del control (p<0.0001) patrón similar al observado por otros autores en el modelo experimental realizado en ratones (16). Este paralelismo permitiría inferir de manera relativamente sencilla el estado celular del corazón del paciente con ICC, mediante biopsia de cualquier músculo estriado (17,18).
En nuestro trabajo se observo que el grupo con ICC, presento una marcada caída en la actividad en-zimática del CIII con respecto al control (p<0.0001). Algunos estudios han demostrado que la cadena respiratoria mitocondrial es una fuente de ROS y que los complejos CI y CIII son los sitios fundamen-tales para la génesis de radicales libres (4). También esta alta tasa metabólica induce a la producción de ROS (19) y de especies reactivas del nitrógeno RNS que en condiciones de normalidad se encuentran en un equilibrio homeostático.
Los ROS son moléculas que en su estructura atómica presentan un electrón de lábil unión en el orbital externo, lo que les da una configuración espacial que genera inestabilidad. Son extraordinariamente re-activos y de vida media corta. Estos ROS son elaborados continuamente como productos del metabo-lismo normal de las células y se inactivan por un conjunto de mecanismos cuya función es equilibrar la producción de ROS y antioxidantes para minimizar y retardar la aparición de daños (20).
Debido a la alta inestabilidad atómica de los ROS, pueden sustraer un átomo de H+ dejandolo oxidado y produciendo que determinadas moléculas pierdan su función específica en la célula. Cuando esto ocurre en las membranas lipídicas celulares, la oxidación de un ácido graso lo convierte en radical de ácido graso con capacidad de oxidar a otra molécula. Este proceso es conocido como lipoperoxidación y permite cuantificar la concentración de los lípidos hidroperoxidados y por ende de ROS, a través de sus productos (ej.nitotorosina)(21).
Nuestro trabajo observamos que los miocardiocitos expresaron una marcación intensa del ONOO- en el 80% de caso con ICC comparado con el control, situación que no se observo con el musculo esquelé-tico.
La formación de los ONOO- esta vinculada a la reacción del NO intramintocondrial con el oxigeno el cual estaría aumentado por el bloqueo del complejo IV (22); dicho bloqueo se observa en proceso que tiendan a aumentar desmesuradamente el NO. La síntesis del NO se debe a las enzimas NOS constitu-cionales e inducibles, estas ultimas aumentan en procesos como enfermedad coronaria, diabetes, proce-sos crónicos. (23, 24) La iNOS en fases iníciales de la ICC presenta función protectora, aunque si se da lugar a un exceso las consecuencias pueden ser fatales debido al bloqueo de la cadena respiratoria (25).
Otro hallazgo observado en este trabajo fue que tejido miocardico del grupo con ICC presento una marcación intensa (80%) de la iNOS con respecto al control, no mostrando dicha diferencia en el mus-culo esquelético.
Entonces se observa una relación entre la mayor marcación de la iNOS y la expresión de nitrotirosina en los miocitos, sugiriendo que en este momento el efecto beneficioso del NO se torna peligroso, debido al aumento crónico de radicales libres (26), deviniendo el fracaso energético mitocondrial y activando diferentes vías de muertes celulares dentro del miocardio (27, 28)
En el presente trabajo se observó una severa alteración estructural en las mitocondrias del músculo ven-tricular izquierdo en paciente que presentaban ICC grado III – IV con respecto al control, asociado a una reducción de la actividad del complejo III y una marcación aumentada de la iNOS y nitrotirosina, observaciones que muestran una clara relación fisiopatologíca entre ellas y permiten entender en parte los proceso celulares y moleculares de la insuficiencia cardiaca.

AGRADECIMIENTOS
Este trabajo se llevó a cabo con subsidios de la Secretaria de Ciencia y Tecnología de la Universidad Nacional de Córdoba y Ministerio de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Córdoba.

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