La flora nativa de Córdoba
(Argentina) y su importancia en salud pública
Brenda Konigheim
,
Javier Aguilar, Gonzalo Batallan, Walter Almirón, Marta
Contigiani.
Revista Facultad de Ciencias Médicas 2009; 66(Supl. 1):
35-41
Laboratorio de Arbovirus,
Instituto de Virología Dr. J.M. Vanella, Facultad de
Ciencias Medicas Universidad Nacional de Córdoba.
Centro de Investigaciones Entomológicas Córdoba (CIEC),
Facultad de Ciencias Exactas físicas y Naturales,
Universidad Nacional de Córdoba.
Introducción
La utilización de medicamentos para tratar enfermedades es
una de las alternativas terapéuticas mas difundida y
aceptada, tanto por los profesionales de la salud como por
la población. Sin embargo, a pesar de los avances
científicos tecnológicos, no hay soluciones a todas las
necesidades terapéuticas, ya que existen aún patologías,
sobre todo aquellas raras o huérfanas, sin un tratamiento
farmacológico efectivo disponible ni medios para prevenirlas
(1).
En las
dos ultimas décadas, de acuerdo a la Organización Mundial de
la Salud (OMS) han aparecido al menos 29 enfermedades nuevas
que han producido la muerte de millones de personas. La
mayor parte de estas enfermedades emergentes son causadas
por virus.
Los
problemas que plantean las infecciones virales
endemoepidémicas emergentes y re-emergentes con la aparición
de brotes de enfermedades sistémicas y/o neurológicas de
diferente magnitud, forman parte de nuestra realidad
cotidiana y constituyen una constante amenaza, no sólo para
nuestro país sino para el resto de América y el mundo. Para
Argentina,
ejemplo de ello es la reciente aparición de virus Dengue y
West Nile (WN), virus trasmitidos por mosquitos (2, 3) y una
variedad enzoótica del virus Encefalitis Equina Venezolana (VEEV)
que fue asociado a un cuadro febril similar al provocado al
virus Dengue (4).
Por otra parte, no debemos dejar de considerar las
patologías virales endémicas que siguen afectando a nuestro
país, como por ejemplo la Fiebre Hemorrágica Argentina, (5)
y
Encefalitis Saint Louis, cuyo virus está ampliamente
distribuido en Argentina y el cual produjo en el año 2002 un
caso de encefalitis en la ciudad de Córdoba, luego de 15
años de ausencia de casos en el país (6)
y a principios del 2005 un brote inédito en la ciudad de
Córdoba (7).
Los antecedentes descriptos muestran la necesidad de
disponer de drogas antivirales efectivas para el tratamiento
de estas patologías regionales, y desarrollar medidas
preventivas para el control del vector de las enfermedades
transmitidas por mosquitos (ESL, Dengue, WN, etc.).
La OMS estima que el 80% de los
habitantes de los países en vía de desarrollo, tienen en las
plantas su principal fuente de medicamentos siendo
indispensables para la atención primaria de la salud. (8).
Así mismo se observa una revalorización del uso de plantas
como fuente de sustancias con propiedades insecticidas (9).
Antecedentes etnobotánicos demuestran que varios géneros de
plantas pertenecientes a la región central de Argentina
pueden ser seleccionados de acuerdo a su uso en la medicina
tradicional para el tratamiento de distintas enfermedades
provocadas por microorganismos (virus, hongos y bacterias) o
su uso como biopesticidas. Entre ellos, podemos destacar los
géneros: Aspidosperma, Larrea,
Minthostachis y Verbascum
(10, 11, 12,13).
El
objetivo de nuestro trabajo fue
evaluar extractos obtenidos a partir de plantas nativas de
Córdoba como potenciales agentes antivirales contra los
virus Junín (VJ), VEEV, Encefalitis de San Luis (VESL) y
Virus Herpes Simple I (VHS-I), y/o con actividad pesticida
sobre Culex quinquefasciatus (vector de VESL).
Materiales y Métodos
Recolección de especies vegetales y obtención de los
extractos
De la
región serrana de la provincia de Córdoba se
recolectaron partes aéreas de las especies: Minthostachys
mollis (Griseb) (“peperina”), Larrea
cuneifolia
Cav. (“jarilla”),
Aspidosperma-quebracho blanco
Schltdl.
(“quebracho”) y
Verbascum thapsus
L. (“ambay”).
Se obtuvieron extractos de diferentes polaridades (Hexano,
Cloroformo, Metanol y agua) utilizando un extractor soxhlet
para el caso de extractos orgánicos y maceración o decocción
para los extractos acuosos. Los extractos acuosos fueron
utilizados únicamente en los ensayos de actividad larvicida.
En todos los casos
para los
estudios de bioactividades,
los extractos
fueron
solubilizados en dimetil sulfóxido (DMSO).
Ensayos de evaluación de citotoxicidad
La
citotoxicidad de los distintos extractos se evaluó sobre la
línea celular Vero crecidas con Medio Esencial Mínimo (MEM),
suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB), glutamina
y gentamicina. Para las pruebas biológicas se utilizo MEM
suplementado con 2% (SFB), glutamina y gentamicina (MM).
Las
metodologías utilizadas fueron:
1)
Observación de alteraciones morfológicas Monocapas
de células Vero se incubaron con MM conteniendo
diferentes concentraciones de los extractos. Se dejaron
controles celulares (CC) con MM sin extracto. El ensayo se
extendió por 3 días a 37ºC. En todos los casos se
consideraron citotóxicas aquellas concentraciones de la
muestra problema que generaron alteraciones morfológicas
tales como redondeamiento, retracción de la membrana y
presencia de gránulos en el citoplasma visibles al
microscopio óptico.
2)
Evaluación de la viabilidad celular con rojo neutro (RN):
El ensayo de citotoxicidad por RN es un ensayo
basado en la capacidad de las células viables para
incorporar el RN como marcador supravital
(14).
Monocapas confluentes de células Vero fueron mantenidas en
cultivo y expuestas a diferentes concentraciones de los
extractos, como CC se dejaron cultivos de células sin
extractos. Al cabo de 48 horas, se eliminó el medio con los
extractos y se agrego una solución de RN de 50 mg/ml en MEM
durante 3 horas. Posteriormente el RN, extraído de las
células con una solución de agua, etanol y ácido acético
(50: 49: 1) se leyó a 540 nm. Se determino la concentración
citotóxica 50 (CC50) utilizando una curva de viabilidad vs.
concentración.
Evaluacion de la inhibicion viral “in vitro”
Los
ensayos de actividad inhibitoria se realizaron en células
Vero empleando como modelos de virus ARN: Virus de
Encefalitis San Luis (VESL) (flavivirus) cepa 78V6508, Virus
Junín (VJ) (arenavirus) cepa XJCl3 y Virus de
Encefalitis Equina Venezolana (VEEV) (alfavirus) cepa TC 83
y como modelo de virus ADN: Herpes simple 1 (HSV-1) cepa kos.
Determinación del título del stock viral:
Se utilizo la prueba reducción de unidades formadoras de
placa (ufp) bajo agarosa en monocapas de células Vero (15)
La
actividad inhibitoria
se determino mediante 2 metodologías:
a)
Tratamiento pre-inoculación (inhibición de las etapas
tempranas de la interacción virus - célula): se mezclaron
distintas concentraciones de los extractos con 100 ufp de
cada uno de los virus, se inocularon inmediatamente sobre
células Vero e incubaron 1 hora a 37ºC en atmosfera húmeda y
5% CO2. Posteriormente se agregó medio semi-sólido
(MEM con agarosa 0.5%) y se incubaron a 37ºC en atmósfera
húmeda y 5%CO2 durante 3 o 7 días dependiendo del
modelo viral. La disminución de la actividad viral fue
medida mediante el análisis de reducción de placa (16).
b) Tratamiento
post-inoculación (inhibición de la replicación viral):
monocapas confluentes de células Vero fueron inoculadas con
100 ufp de cada virus, y luego de 1 hora de incubación a 37º
C en atmósfera húmeda y 5%CO2 se agregó MM
conteniendo distintas concentraciones de cada extracto. La
disminución de la actividad viral se midió utilizando el
método de captación de RN (17).
Cría
de Cx. quinquefasciatus.
La
metodología de cría siguió las pautas generales de Gerber et
al. (18).
Los adultos fueron colectados en la Ciudad de Córdoba, se
mantuvieron en jaulas entomológicas de 30 x 30 x 30 cm y
fueron alimentados con agua azucarada al 10%. Se utilizaron
codornices inmovilizadas como fuente de sangre para las
hembras. Las larvas fueron criadas en bandejas plásticas de
1000 ml de capacidad y alimentadas diariamente con hígado en
polvo (0.25 mg/larva/día).
Las
condiciones ambientales en el laboratorio fueron de 25 ± 2°
C y
fotoperíodo de 12 h luz.
A partir de las colonias se obtuvieron las larvas y adultos
hembras necesarias para cada ensayo.
Evaluación de actividad larvicida.
Se probaron 3 concentraciones (0.5, 0.25 y 0.1 mg/ml) de
cada extracto vegetal, los cuales se aplicaron en bandejas
plásticas que contenían 30 larvas del III estadio en 100 ml
de agua destilada. Se utilizó un fotoperiodo de 12 h luz a
25
±
2 ºC. Las larvas se alimentaron diariamente con hígado en
polvo (0.25 mg/larva/día). Se utilizaron como controles
bandejas con 3 concentraciones de DMSO (0.5, 0.25, y
0.1ml/ml) y con agua solamente. Se realizaron 5 réplicas
para cada tratamiento y se registró la mortalidad larval
cada 24 h.
Para
evaluar el efecto larvicida de los extractos se realizó un
ANAVA y como test a posteriori se usó el test de Duncan (α =
5%). Para los extractos que provocaron una mortalidad del
100% a la mayor concentración, se estimó la dosis letal 50
(DL50) y la dosis letal 90 (DL90)
utilizando una regresión Probit.
Resultados
En la
tabla I se muestran los resultados de citoxicidad obtenida
para cada extracto de todas las especies vegetales,
expresados como CC50. A partir de estos valores se
calcularon las concentraciones de cada extracto utilizado en
los ensayos antivirales, asegurando que la cantidad de
extracto utilizada no resultara tóxico para la célula
huésped.
Se pudo
observar que ningún extracto, independientemente de la
especie vegetal, tuvo acción sobre VESL. VJ solo fue
inhibido cuando se utilizo el ensayo de pre-tratamiento,
con L. cuneifolia (Cloroformo 90%, Metanol 100%)
ninguna de las otras especies vegetales fue capaz de
inhibir al VJ en las condiciones metodológicas empleadas.
VEEV fue inhibido únicamente en el pretratamiento por
V.thapsus (Hexano 60%). Con el post-tratamiento
fue inhibido por A. quebracho-blanco (cloroformo
50-70%), M. mollis (cloroformo y metanol 50-100%) y
V .thapsus (metanol 70%). Sobre HSV- I se pudo
determinar que ninguna de las 4 especies fueron capaces de
inhibirlo cuando se utilizó el pre-tratamiento. A.
quebracho-blanco (hexano 50-60%, cloroformo 50-70%),
M. mollis (Cloroformo 60-80%, metanol 60-100%) y
V.thapsus (hexano 60%, metanol 100%) fueron capaces de
inhibir al virus con el post-tratamiento. Cabe destacar que
los extractos hexanicos de L. cuneifolia y M. mollis,
y metanolico de A. quebracho-blanco no mostraron
actividad sobre ninguno de los virus ensayados.
En
referencia a la actividad pesticida A. quebracho-blanco
mostro que el mayor efecto larvicida se obtuvo con el
extracto clorofórmico y el hexánico a la concentración más
alta, ocasionando un 99 y 85 % de mortalidad
respectivamente. Las mortalidades observadas a la
concentración de 0,25 mg/ml fueron del 73 y 57 % para ambos
extractos respectivamente. A su vez las mortalidades
registradas a la menor concentración fueron bajas (< 46%).
El extracto metanólico no mostró actividad larvicida.
L. cuneifolia
mostró
una
elevada actividad larvicida a las 3 concentraciones
empleadas del extracto clorofórmico, siendo la mortalidad
del 100% para las dos concentraciones más altas y del 95,33%
para 0.1 mg/ml. El extracto obtenido con metanol presentó
buena actividad solo a la concentración de 0,5 mg/ml,
ocasionando una mortalidad del 83,3%. Los extractos acuosos
mostraron baja actividad larvicida con mortalidades que
oscilaron entre 29,33 y 1%
para las 3 concentraciones probadas.
Para M.
mollis la mortalidad fue del 100% con las
concentraciones más altas de los extractos de hexano y
cloroformo a las 24 h de su aplicación, en tanto que a
0,1mg/ml fue del 43% y 38%, para ambos extractos
respectivamente. El extracto metanólico produjo bajos
porcentajes de mortalidad (8-28%) con las tres
concentraciones empleadas.
En cuanto a V. thapsus
solo se probaron el extracto metanólico y los extractos
acuosos. La mayor actividad larvicida se detectó con el
extracto metanólico a la mayor concentración, registrándose
una mortalidad del 83,33%. Los extractos acuosos no
mostraron efecto larvicida ocasionando bajas mortalidades
(<15%).
Las DL50
y DL90 estimadas para aquellos
extractos que presentaron actividad larvicida, se detallan
en la tabla II.
Discusión y Conclusión
La OMS
estima que el 80% de los habitantes de los países en vía de
desarrollo, tienen en las plantas su principal fuente de
medicamentos siendo indispensable su empleo en la atención
primaria de la salud.
En el
presente estudio se evaluaron actividades biológicas
(antiviral y pesticida) de 4 especies vegetales
pertenecientes a la flora autóctona argentina: Larrea
cuneifolia, Mintostachys mollis, Verbascum thapsus y
Aspidosperma quebracho-blanco. Los resultados obtenidos
indican que estas especies mostrarían potencial para ser
empleadas tanto como insecticidas o antivirales.
Los
estudios etnobotánicos realizados en nuestro país son
escasos y poco se conoce sobre las propiedades antivirales
de la flora autóctona. Sin embargo varios géneros de plantas
de nuestro país pueden ser seleccionados de acuerdo a su uso
en la medicina folclórica para resolver problemas de
enfermedades provocadas por virus.
En la
tabla I, donde se observan
los valores de CC50 obtenidos para cada extracto
de cada especie vegetal, se puede destacar que
Mintostachys mollis
mostró ser la planta menos tóxica, en tanto que el extracto
clorofórmico de Verbascum thapsus fue el más tóxico
con una CC50 de 8 µg/ml.
Los
extractos de Larrea cuneifolia, principalmente el
clorofórmico, demostraron poseer actividad sobre VJ cuando
se utilizo el pre-tratamiento, y esto sugiere que la acción
producida podría ser sobre alguna etapa temprana de la
relación virus célula, por ejemplo durante la adhesión del
virus a los receptores celulares. Estudios previos
realizados por nuestro grupo con extractos de Larrea
divaricata, especie relacionada y con igual distribución
geográfica que L cuneifolia, demuestran actividad
antiviral contra VJ (16). Con el resto de las plantas no
observamos inhibición sobre VJ.
Para HSV-I,
excepto L. cuneifolia, todas las plantas tuvieron
algún efecto sobre este virus, observándose que A.
quebracho-blanco, V. thapsus y M. mollis
inhibieron solamente al virus en el post-tratamiento,
sugiriendo que la actividad inhibitoria ocurre
principalmente sobre etapas posteriores al ingreso del virus
a la célula, como por ejemplo en la síntesis de proteínas
virales, entre otras. No existen antecedentes previos de
esta actividad biológica para A. quebracho blanco,
para la cual también se detectó actividad inhibitoria en el
post-tratamiento sobre VEEV al igual que, M. mollis y
V. thapsus, de las cuales tampoco se conocía actividad sobre
este virus.
Cabe
destacar que ninguna especie vegetal, tuvo efecto sobre el
VESL
En
cuanto a la actividad pesticida de las plantas analizadas se
observó que en líneas generales los extractos acuosos
generaron baja o nula mortalidad de larvas, mientras que los
extractos clorofórmicos y hexánicos de todas las especies
vegetales presentaron elevada actividad larvicida
(mortalidad de larvas ≥80%).
Son
numerosas las especies de plantas provenientes de diferentes
regiones del mundo que presentan actividad pesticida en
culícidos (19, 20, 21, 22, 23,24). Sin embargo, la
información respecto a esta actividad en plantas autóctonas
de nuestro país es escasa. No existen estudios previos
sobre el efecto larvicida de ninguna de las especies
probadas en este trabajo. Hasta el momento solo se ha
reportado la actividad repelente del aceite esencial de
M. mollis sobre Aedes aegypti (20). Los
resultados obtenidos en este trabajo son particularmente
interesantes ya que se observó efecto larvicida de algunos
extractos de especies autóctonas de la provincia de Córdoba,
resultando potencialmente efectivos para el control de Cx.
quinquefasciatus,.
El
presente estudio tiene gran importancia ya que hemos
encontrado que diferentes especies nativas tienen capacidad
para inhibir virus de importancia médica como VJ, VHS I y
VEEV, en este sentido, los resultados obtenidos justifican
la planificación de trabajos futuros con el fin de
identificar los metobolitos responsables de la actividad
observada, como así también profundizar el estudio para
evaluar su posible uso como medicamentos fitoterápicos.
Por otro
lado no hemos encontrado plantas con actividad contra el
VESL, sin embargo algunas de ellas presentaron actividad
larvicida contra su vector (Cx. quinquefasciatus) por
este motivo sería conveniente realizar estudios de campo
para confirmar los resultados obtenidos y evaluar la
factibilidad de su uso en el control de estos mosquitos de
gran importancia sanitaria.
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Tablas
Tabla
1
Especie Vegetal |
Extractos |
CC50
(g/ml) |
Pre- tratamiento
(% Inhibición viral) |
Post –tratamiento
(% Inhibición viral) |
VJ |
VESL |
VEEV |
HSV-I |
VJ |
VESL |
VEEV |
HSV-I |
Larrea cuneifolia |
Hexano |
55 |
- |
- |
- |
- |
ND |
ND |
ND |
ND |
Cloroformo |
27 |
90% |
- |
- |
- |
ND |
ND |
ND |
ND |
Metanol |
98 |
100% |
- |
- |
- |
ND |
ND |
ND |
ND |
Aspidosperma quebracho-blanco |
Hexano |
11 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
20-30 % |
50-60 % |
Cloroformo |
18 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
50-70 % |
50-70 % |
Metanol |
141 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Mintostachys mollis |
Hexano |
231 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
Cloroformo |
290 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
50-100% |
60-80 % |
Metanol |
800 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
50-100% |
60-100% |
Verbascum thapsus |
Hexano |
47 |
- |
- |
60% |
- |
- |
- |
30% |
60% |
Cloroformo |
8 |
- |
- |
- |
- |
- |
- |
20% |
30% |
Metanol |
36 |
- |
- |
30% |
- |
- |
- |
70% |
100% |
Tabla
I. Tabla comparativa de
citotoxicidad mediante la metodología de captación de Rojo
Neutro y de actividad inhibitoria (pre y post –tratamiento)
de los extractos de las diferentes especies vegetales sobre:
VJ
(Virus Junín), HSV-I (Herpes simple tipo 1);
VESL (Virus Encefalitis San Luis), VEEV (Virus
Encefalitis Equina Venezolana).
(-):
Sin Actividad
(ND.): No determinado.
Tabla 2
Extracto Botánico |
DL50 (95%CL) |
DL90 (95%CL) |
Ecuación de Regresión |
Chi cuadrado |
M.
mollis |
|
|
|
|
Hexano |
0.137 (0.127-0.149) |
0.207 (0.191-0.228) |
y
= 18.465x-2.539 |
11.656 |
Cloroformo |
0.166 (0.155-0.177) |
0.227 (0.213-0.244) |
y
= 20.841x-3.448 |
10.815 |
L. cuneifolia |
|
|
|
|
Cloroformo |
0.062 (0.044-0.08) |
0.130
(0.107-0.172) |
y
= 18.814x-1.166 |
50.179 |
A. quebracho-blanco |
|
|
|
|
Cloroformo |
0.138 (0.112-0.165) |
0.350 (0.308-0.411) |
y
= 6.051x-0.839 |
20.172 |
Tabla
II:
DL50 y DL90 estimadas para
los extractos que presentaron actividad larvicida.

|