Detección del virus de la
hepatitis C (VHC) en saliva de pacientes crónicamente
infectados de Córdoba, Argentina.
Adrián Farías,
¹ Viviana Ré,
¹
Silvia Mengarelli,
²
Luis Kremer, ³
Maria Belén Pisano¹,
Luis Allende³,
Juan Nicolás, Osvaldo Elbarcha, Marta Contigiani¹.
Revista Facultad de Ciencias Médicas 2009; 66(Supl. 1):15-20
1 Instituto de Virología
“Dr. J. M. Vanella”, Facultad de Ciencias Médicas –
Universidad Nacional de Córdoba, Córdoba,
Argentina.
2 Hospital San Roque-Córdoba, Argentina.
3 Hospital Nacional de Clínicas-Córdoba, Argentina.
4 Cátedra de Virología. Facultad de Ciencias Químicas.
Universidad Católica de Córdoba, Argentina.
Introducción
En los últimos 20 años el virus de la hepatitis C (VHC) ha
emergido como la segunda principal causa de infección viral
luego del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se
estima que aproximadamente el 3% de la población mundial
está infectada con VHC y ésta infección es crónica en el 80%
de los casos (1).
El VHC comparte vías de transmisión con VIH, pero las tasas
de infección están relacionadas al nivel de exposición de la
población involucrada. Así, la coinfección VIH/VHC
representa un gran problema en crecimiento. Esta coinfección
acelera la progresión de injuria y descompensación hepática
provocada por VHC, parece empeorar la progresión de la
infección por VIH e incrementa la transmisión de VHC (2).
En
Córdoba, un estudio reciente en individuos VIH (+), demostró
una alta prevalencia de HCV (12,3%), representada por el
genotipo 1 y asociada principalmente al uso de drogas
inyectables. Sin embargo, el hallazgo de ARN de VHC en 10,5%
de los individuos sin antecedentes de riesgo parenteral
sugería una vía alternativa de transmisión (3).
Si bien, la vía de transmisión parenteral se considera la
más eficiente, en aproximadamente 30% de los casos se
desconoce la ruta de infección (1). Por esto, se han
propuesto otras vías posibles de transmisión, de riesgo
incierto, que podrían estar relacionadas a la infección por
VHC como son:
el uso
de tatuajes,
el uso de cocaína inhalatoria,
acupuntura y procedimientos médico- odontológicos (4, 5, 6).
Estudios
recientes han demostrado la presencia de
ARN
de VHC en saliva de individuos crónicamente infectados, lo
cual sugiere a ésta como otra posible vía de infección (7).
A su vez, se ha demostrado que niveles
mayores de carga viral favorecerían la detección de VHC en
saliva (7, 8, 9). El aumento de la replicación de VHC
favorecido por la inmunosupresión en pacientes VIH (+) y/o
por la presencia de infección VHC aguda, podría estar
asociada a un aumento de la replicación viral en células
mononucleares de sangre periférica y células epiteliales de
la mucosa genital u oral, en las que se demostró que poseen
un receptor celular (CD81) que une la proteína de la
envoltura del VHC y produce la internalización del virus
(10). Esto podría explicar el hallazgo de VHC en otros
fluidos biológicos, que podrían estar involucrados en la
transmisión del virus (10).
El objetivo de este estudio fue evaluar la presencia de ARN
en la saliva de individuos crónicamente infectados y
estudiar el real impacto de la coinfección con VIH, y su
asociación con
la carga viral, el genotipo VHC, factores de
riesgo
y edad.
Materiales y Métodos
Pacientes y toma de muestras
Se estudiaron 37 pacientes (21 males/16 mujeres), dieciséis
de ellos eran co-infectados con VIH. Todos los sujetos
tenían ARN del VHC detectable en el suero mediante RT-Nested
PCR y no se encontraban bajo tratamiento antiviral. Las
muestras de suero fueron re-analizadas para confirmar la
presencia de ARN del VHC en el momento de tomar las de
saliva. Todos los especímenes fueron congeladas a -70oC
hasta la detección del ARN viral.
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la
Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Córdoba y
se llevó a cabo de acuerdo con las normas de ética
internacionales. Se obtuvo el Consentimiento informado por
escrito de todos los pacientes incluidos en este estudio.
Procesamiento de Suero y Saliva
En todos los pacientes, se recolectó muestras de sangre y se
separó el suero, el cual se almacenó a-20oC hasta
su procesamiento.
Las muestras de saliva se recogieron sin estimulación
mecánica en un tubo (Falcon) estéril. La saliva fue
procesada por centrifugación y se realizó un control visual
para detectar la presencia de células de la sangre. Ninguna
de las muestras contenía sangre en el exámen macroscópico.
Extracción de ARN
A partir de suero, la extracción de ARN viral se realizó con
el reactivo Trizol LS (Invitrogen, Life Technologies,
Rockville, MD). En la muestras de saliva se utilizó el ARN
viral QIAamp Kit (QIAGEN GmbH, Alemania) según las
instrucciones del fabricante.
RT-nested PCR
La presencia de ARN del VHC se determinó mediante la técnica
de RT-nested PCR utilizando primers específicos de la
región 5 'no codificante (5'NCR), como fue descrito por Ré
y col., (11).
Genotipificación
La determinación del genotipo del VHC se realizó mediante el
análisis de polimorfismo de la longitud de los fragmentos de
restricción (RFLP) de la región 5'NCR. Este método (RFLP)
permitió distinguir adecuadamente los genotipos 1, 2 y 3
(11).
Secuenciamiento de la región NS5B
La amplificación de la región no estructural 5B (NS5B) y
posterior secuenciamiento directo se realizó como se
describió anteriormente por Chen y Weck, (12); a fin de
confirmar los resultados obtenidos por la técnica de RFLP.
Cuantificación del ARN del VHC en el suero
El ARN del VHC en el suero se cuantificó con el equipo QT
VHC NASBA (Organon Teknika, Boxtel, Países Bajos).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se realizó mediante SPSS para
Windows y los valores de p < 0,05 fueron considerados
significativos. El Test de Student se usó para
comparar las variables continuas y Chi-cuadrado o
prueba exacta de Fisher para la comparación de
proporciones.
Resultado
Las
características de la población, edad, sexo, factores de
riesgo, carga viral del VHC en suero y los genotipos de VHC
fueron registradas (Tabla I).
La prevalencia de ARN del VHC en la saliva fue del 21.6 % (8
/ 37). Los resultados de la detección de VHC en saliva y su
asociación con la vía de transmisión de VHC, la edad,
coinfección con VIH, genotipo y carga viral del VHC se
muestran en la Tabla II.
La
distribución de los genotipos del VHC en los pacientes
monoinfectados fue la siguiente: 48% (10/21) de genotipo 1,
43% (9 / 21) genotipo 2 y el 9% por el genotipo 3 (2 / 21).
Para los pacientes co-infectados VIH/VHC, la distribución de
genotipos fue de 76% (13/17), el 6% (1 / 17) y el 18% (3 /
17), respectivamente (Tabla I).
Los
genotipos detectados en suero coincidieron con los
detectados en saliva.
Discusión
La
posibilidad de que la saliva sea una vía no parenteral de
transmisión ha sido sugerida por una gran variedad de
estudios. Ya en 1987, un estudio realizado por Abe y col.,
(13) describe la infección aguda en un chimpancé luego de la
inoculación de saliva de un primate con hepatitis no A- no
B. Estudios basados en la amplificación molecular de ARN de
VHC en saliva reportan resultados variados con rangos de 0
(14) a 100% (15). Sin embargo, ninguno de estos estudios
incluye datos que demuestran la infectividad del ARN del VHC
detectado en saliva. En este sentido, Arrieta y col., (16)
reportaron la detección de intermediario replicativo y
antígeno core de VHC en el tejido de la glándula salival de
8 pacientes crónicamente infectados.
En
nuestro estudio, demostramos la presencia de ARN- VHC en el
21,6% de las salivas estudiadas, mucho menor a la
prevalencia hallada por Gonzalvez y col., (17). Las
discrepancias encontradas entre los estudios reportados
podrían deberse a la ausencia de métodos estandarizados
tanto para la toma de muestras como para los métodos de
centrifugación, congelación y detección de este virus en
saliva. Otra explicación posible podría darse en la
presencia de sangre oculta y/o de células en las salivas de
estudio. A pesar de que a VHC se lo ha encontrado en los
leucocitos y las células epiteliales orales (16), las
muestras de saliva de este estudio estaban libres de tales
células. Las pruebas específicas para investigar sangre
oculta no se realizaron en este trabajo, pero algunos
autores (16,17) han demostrado que entre las personas
infectadas con el VHC, la presencia de sangre en muestras de
saliva no se correlaciona con la presencia de ARN del VHC en
suero (16).
La
asociación entre el nivel de ARN de VHC y la excreción en
mucosa parece variar durante el curso de la infección. Según
fue demostrado por varios autores el ARN es más
frecuentemente hallado en saliva cuando la carga viral en
suero es mayor (7, 8, 9). Así factores clínicos que están
asociados a mayores cargas virales, tales como infección
aguda o coinfección VIH/VHC pueden resultar en mayor
frecuencia de detección de VHC en saliva.
En
concordancia con
Lins
y col.,
(18) en nuestro estudio no se halló correlación
estadísticamente significativa (p>0.05) entre la
presencia de ARN del VHC vs. carga viral y coinfección con
VIH. Sin embargo, un mayor porcentaje de detección en saliva
se observó cuando la carga viral fue superior a 5 Log (Tabla
II).
En
cuanto a la detección de genotipos de VHC hallamos igual
genotipo en las muestras de suero y saliva de un mismo
paciente. Sin embargo, estudios más detallados del genoma
viral (subtipos – cuaciespecies) se realizarán en un futuro
a fin profundizar estos resultados. En este sentido,
recientemente se ha demostrado que VHC posee replicación
extrahepática y varios reportes han demostrado
variantes virales intratípicas dentro de los diferentes
compartimentos corporales (19, 20, 21).
Nuestros datos muestran que el ARN de VHC está presente en
la saliva de individuos infectados con este virus, el
mecanismo de excreción de VHC y el rol que cumple ésta en la
actual transmisión de la infección a otros individuos aún no
está claro. Múltiples factores contribuyen a la infectividad
de un fluido biológico, incluyendo la presencia de
partículas virales intactas, el título viral adecuado y la
presencia de células blancos adecuadas en el área expuesta
del individuo susceptible. Actualmente, los datos
epidemiológicos no acompañan el concepto de que VHC es
eficientemente transmitido mediante saliva. Sin embargo, el
uso de cepillo de dientes y los tratamientos odontológicos
han sido imputados como vehículos para la transmisión de VHC
en varios estudios (22).
Si bien,
nuestros resultados, juntamente con los hallazgos de otros
autores sustentan la posibilidad de que VHC pueda ser
transmitido por saliva en ciertas y determinadas
circunstancias, los hallazgos deben ser interpretados con
mucha precaución, para evitar una innecesaria preocupación
en los individuos infectados por HCV.
Asimismo, los resultados deben ser tenidos en consideración
a fin de guardar las medidas de bioseguridad apropiadas en
la atención médico-odontológica.
Agradecimientos
Este estudio fue subsidiado parcialmente por SECYT
(Secretaría de Ciencias, Tecnología e Innovación Productiva,
Argentina) y SIP-UCC (Secretaría de Investigación y
Posgrado- Universidad Católica de Córdoba).
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Tablas
Tabla
I.
Características de la población de estudio y determinación
del genotipo en 37 pacientes infectados con VHC de Córdoba,
Argentina.
Variables |
HCV
mono infectedos |
HCV/HIV
co-infectedos |
Edad (promedio) |
45 |
38 |
Sexo |
|
Masculinos |
10 |
11 |
Femeninos |
11 |
5 |
Total |
21 |
16 |
Riesgo Parental* |
|
Transfusión |
6 |
2 |
UDEV |
3 |
13 |
Cirugía |
13 |
5 |
Riesgo Incierto** |
6 |
2 |
VHC Genotipos |
|
Genotipo 1 |
10 |
13 |
Genotipo 2 |
9 |
1 |
Genotipo 3 |
2 |
2 |
Carga viral VHC (promedio) log |
4,6 |
5,6 |
Tratamiento Antiretroviral |
-- |
No |
*
En algunos casos se observó más de un riesgo
por paciente
**
Historia de atención odontológica, medicación
con inyectables, transmisión familiar (compartir hojas de
afeitar, cepillos de dientes y peines), tatuaje, múltiples
parejas sexuales, hombres que tienen sexo hombres (HSH) o
diferentes hábitos sexuales.
Tabla
II.
Detección de ARN del VHC en saliva de 37 pacientes
infectados con VHC de Córdoba, Argentina
Variables* |
Saliva |
Genotipos |
N |
% |
1 |
5 |
63 |
2 |
2 |
25 |
3 |
1 |
12 |
Edad |
|
|
> 40 |
5 |
63 |
< 40 |
3 |
37 |
UDEV |
|
|
SI |
5 |
63 |
No |
3 |
37 |
VHC Carga viral
|
|
|
> 5 log |
7 |
88 |
< 5 log |
1 |
12 |
VIH co-infeción |
|
|
Si |
5 |
63 |
No |
3 |
37 |
Cirugía |
|
|
Si |
3 |
37 |
No |
5 |
63 |
Transfusión |
|
|
Si |
3 |
37 |
No |
5 |
63 |
Riesgo Incierto |
|
|
Si |
2 |
25 |
No |
6 |
75 |
* En todos los casos p>0,05

|