Actividad de virus del
complejo encefalitis equina venezolana (VEEV) en Argentina.
María B. Pisano
¹
,
Viviana E. Ré ¹,
Luis A. Díaz ¹,
Marina Stein ²,
María J. Dantur
Juri³,
Adrián Farías ¹,
María P. Sanchez–Seco 4,
Antonio Tenorio 4
, Walter R. Almirón 5,
Marta S. Contigiani
¹.
1-Instituto de Virología “Dr. J.
M. Vanella”. Fac. Cs. Médicas. UNC. Córdoba, Argentina. 2-
Instituto de Medicina Regional. UNNE. Chaco, Argentina. 3-
INSUE. UNT. Tucumán, Argentina. 4- Instituto de Salud Carlos
III. Majadahonda, España. 5- Centro de Investigaciones
Entomológicas de Córdoba, FCEFyN. UNC. Córdoba, Argentina.
INTRODUCCIÓN
Dentro de los alfavirus aislados en América de importancia
médico-veterinaria, se encuentra el complejo antigénico
Encefalitis Equina Venezolana (EEV), que consta de seis
subtipos (I a VI). El subtipo I, a su vez, posee las
variedades IAB, C, D, E y F, y el subtipo III las variedades
A, B y C. Epidemiológicamente se clasifican en virus
enzoóticos y virus epidémicos/epizoóticos. Los primeros
(subtipos ID, IE, IF y II al VI), son transmitidos a través
de roedores reservorios por mosquitos en hábitats silvestres
y ocasionalmente producen enfermedad en humanos. Sin
embargo, recientemente un brote epizoótico en México tuvo
como responsable al subtipo IE (1). Las cepas
epidémicas/epizoóticas (subtipos IAB y IC) emergen
periódicamente en regiones de América Central y el norte de
América del Sur (Venezuela, Colombia, Ecuador y Perú),
causando brotes que afectan a humanos y equinos con altas
tasas de morbilidad y mortalidad (2).
En Argentina se ha aislado la cepa AG80-663 (subtipo VI)
(actualmente denominada Virus Rio Negro, VRN, y que sólo
circula en nuestro país) a partir de mosquitos (3) y de
roedores, la cual ha sido asociada a enfermedad aguda febril
(4). Por otra parte, estudios serológicos mostraron la
presencia de anticuerpos para virus del subtipo I (aún no
aislado en la Argentina) y para VRN, lo que indica que más
de un subtipo viral enzoótico es activo en nuestro
territorio (5).
Con el objetivo de monitorear actividad del virus EEV en
Argentina, se realizó detección del ARN viral mediante RT-Nested
PCR genérica para alfavirus en las provincias de Chaco y
Tucumán, con posterior secuenciamiento de las muestras
positivas y análisis filogenéticos de las mismas.
MATERIALES Y MÉTODOS
Se colectaron mosquitos en diciembre de 2003 y desde
febrero hasta abril de 2004 en la provincia de Chaco
(localidades de Monte Ato y Resistencia); y en los meses de
marzo, abril, noviembre y diciembre de 2005 y febrero de
2006 en la provincia de Tucumán (San Miguel de Tucumán),
mediante trampas de luz tipo CDC complementadas con CO2.
Estos mosquitos fueron transportados en frio hasta el
laboratorio, donde fueron identificados bajo microscopio
estereoscópico y platina refrigerada, y agrupados en pools
de hasta 50 individuos por especie. Cada pool fue triturado
en mortero frio con Medio Esencial Mínimo (MEM) estéril,
suplementado con Suero Fetal Bovino (SFB) al 10% y
gentamicina al 1%, y descontaminado por centrifugación a
10000 rpm durante 30 minutos. El sobrenadante fue alicuotado
y conservado a -70ºC hasta detección viral.
El ARN viral fue extraído con el reactivo Trizol (Invitrogen
BRL, Life Technologies, Rockville, MD) de acuerdo al
protocolo del fabricante. Posteriormente se realizó RT-Nested
PCR genérica para alfavirus, amplificando un fragmento de la
proteína no estructural 4 (nsP4) (6). Las muestras positivas
fueron purificadas utilizando el kit comercial Quiaquick Gel
Extraction Kit (Quiagen, Valencia, Ca, USA) y remitidas para
secuenciamiento directo en ambas direcciones. Las secuencias
obtenidas fueron ingresadas en el banco de datos GenBank.
Los análisis filogenéticos fueron construidos con el
programa Mega versión 4. Las Tasas Mínimas de Infección (TMI)
fueron calculadas de la siguiente manera: TMI = número de
amplificaciones virales por especie/número total de
especímenes testeados de esa especie para un lugar x 1000.
RESULTADOS
Provincia de Chaco
Se analizaron 2057 mosquitos, agrupados en 99 pools,
pertenecientes a 33 especies. Siete pools resultaron
positivos para alfavirus: 5 de Monte Alto y 2 de
Resistencia. Las Tasas Mínimas de Infección (TMI) mostraron
más actividad viral en Monte Alto (área rural) que en
Resistencia (área urbana) (Tabla I). Seis secuencias,
obtenidas de Culex (Cx.) coronator, Cx. maxi, Psorophora (Ps.)
cingulata, Ps. spp y Ps. varinervis, agruparon con VRN (VEEV
subtipo VI); y una, obtenida de Oclerotatus (Oc.) hastatus
oligopistus, agrupó con Virus Pixuna (VPIX) (VEEV subtipo IV)
(Figura 1).
Provincia de Tucumán
Se analizó un total de 4700 mosquitos, agrupados en 139
pools, pertenecientes a 16 especies. Cuatro pools resultaron
positivos para alfavirus: 2 obtenidos de Ae. (oc.)
scapullaris, uno de Cx. mollis, y uno de Ae. aegypti. Las
TMI muestran una actividad viral mayor en Cx. mollis que en
las otras especies (Tabla I). Tres pools fueron
secuenciados: 2 agruparon con VRN y uno con VPIX (Figura 1).
DISCUSIÓN
Estudios previos en Argentina, llevados a cabo en la
provincia de Chaco, postulan Cx. (Mel.) delpontei como el
principal vector de VRN (Mitchell et al. 1985). Los datos
obtenidos en esta investigación muestran presencia de este
virus en mosquitos de otras especies. La no detección de VRN
en Cx. (Mel.) delpontei puede deberse a que se colectaron
pocos mosquitos de esta especie, en el caso de la provincia
de Chaco, y ninguno en la provincia de Tucumán, en donde no
hay registros de circulación de la misma hasta la fecha.
Al momento del comienzo de este estudio, en Argentina se
conocía la circulación de VRN en la provincia de Chaco.
Nuestros resultados confirman que este virus aún circula en
la región. Sin embargo, no hay registros previos de
detección de VPIX, siendo éste el primer reporte de su
detección molecular en el país. Este virus fue aislado por
primera vez en Belem, Brasil, en 1961 (7), y ha sido poco
caracterizado.
En cuanto a la provincia de Tucumán, nuestros resultados
muestran por primera vez presencia de virus del complejo EEV
en mosquitos de esa provincia, coexistiendo circulación de
dos subtipos enzoóticos, VRN y VPIX, los mismos detectados
en la provincia de Chaco. Esto es de especial importancia ya
que se ha observado emergencia de cepas epizoóticas
patógenas vía mutación de cepas enzoóticas (por interacción
entre dos cepas o por mecanismos genéticos de adaptación a
nuevos huéspedes) (Powers et al. 1997).
Los datos informados en este trabajo demuestran la necesidad
de desarrollar y/o reforzar medidas de vigilancia
epidemiológica para el virus EEV en la región norte de
nuestro país, a fin de conocer su importancia como patógeno
en el área, como así también intensificar medidas de control
de vectores, no sólo para este virus, sino para las
arbovirosis en general.
Teniendo en cuenta que el VRN fue asociado a enfermedad
aguda febril durante un brote humano notificado como posible
Dengue (4) es recomendable incluir este virus en el
diagnóstico diferencial de síndromes febriles.

BIBLIOGRAFIA
1-González-Salazar D, Estrada-Franco JG, Carrara AS,
Aronson JF, Weaver SC.
Equine amplification and virulence of subtype IE Venezuelan
equine encephalitis viruses isolated during the 1993 and
1996 Mexican epizootics. Emerg Infect Dis; 2003,
9:161-168.[Full
Text]
2-Powers A, Oberste M, Brault A, Rico-Hesse R, Schmura S,
Smith J, Kang W, Sweeney W, Weaver S.
Repeated emergence of epidemic/epizootic Venezuelan Equine
Encephalitis from a single genotype of enzootic subtype ID
virus. J Virol; 1997, 71: 6697-6705.
[Full Text]
3-Mitchell CJ, Monath TP, Sabattini, MS, Cropp C, Daffner J,
Calisher C, Christensen H.
Arbovirus Investigations in Argentina, 1977-1980. II.
Arthropod collections and virus isolations from Argentine
mosquitoes. Am J Trop Med Hyg; 1985, 34 (5): 945-955.[Abstract]
4-Contigiani M, Basualdo M, Cámara A, Ramírez A, Díaz G,
González D, Medeot S, Osuna D. Presencia de anticuerpos
contra virus de la encefalitis equina venezolana subtipo VI
en pacientes con enfermedad febril aguda. Rev Arg Microbiol;
1993, 25: 244-251.
5-Cámara A, Díaz G, Vega V, Basualdo M, Contigiani M.
Seroprevalence of antibodies to Venezuelan Equine
Encephalitis Complex (subtypes IAB and VI) in humans from
General Belgrano island, Formosa, Argentina. Rev Inst
Med Trop S Paulo; 2003, 45: 201-204.[Abstract]
6-Sánchez-Seco MP, Rosario D, Quiroz E, Guzmán G, Tenorio A.
A
generic nested-RT-PCR followed by sequencing for detection
and identification of members of the alphavirus genus. J
Virol Meth; 2001, 95: 153-161.[Abstract]
7-Shope RP, Causey OR, Andrade AH, Theiler, M.
The Venezuelan Equine Encephalomyelitis complex of group A
arthropod-borne viruses, including Mucambo and Pixuna from
the Amazon region of Brazil. Am J Trop Med Hyg; 1964,
13: 723-727.
[Full Text]

|